Thèse Contribution à l'Étude de l'Implication Physiologique et Physiopathologique du Canal Hcn4 dans le Tissu Cardiaque Implication au Niveau Mitochondrial et Caractérisation de Variants Rares du H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université d'Angers École doctorale : École doctorale Biologie Santé Laboratoire de recherche : PHYSIOPATHOLOGIE MITOCHONDRIALE ET CARDIOVASCULAIRE Direction de la thèse : Christian LEGROS Date limite de candidature : 2026-05-22T00:00:00 Chaque battement cardiaque résulte de la contraction synchrone de millions de cellules musculaires cardiaques, processus connu sous le nom de couplage excitation-contraction (ECC). L'initiation des potentiels d'action (PA) cardiaques dans le noeud sino-auriculaire (SAN), le principal pacemaker du coeur, dépend de courants ioniques spécifiques, parmi lesquels les canaux activés par hyperpolarisation et modulés par les nucléotides cycliques (HCN) jouent un rôle majeur en régulant l'automaticité cardiaque. Ils génèrent un courant dépolarisant lent If (« funny »), responsable du déclenchement spontané des PA et présentant un rôle déterminant dans la fréquence cardiaque intrinsèque. Parmi les 4 sous-types de canaux HCN (HCN1-4) exprimés dans le tissu cardiaque, HCN4 apparaît comme le plus abondant dans le SAN, tandis que HCN1/HCN2 sont principalement exprimés dans les myocytes atriaux et ventriculaires 1 . Chez l'animal, il a été montré que des altérations de l'expression des canaux HCN2 et HCN4 sont associées à une augmentation du risque de fibrillation atriale ou d'arythmies. Chez l'Homme, plusieurs variants du gène HCN4 ont été identifiés chez des patients présentant des arythmies cardiaques (syndrome de Brugada) et de dysfonction du SAN. Ainsi, les canaux HCN sont associés à diverses pathologies cardiaques, et constituent une cible thérapeutique validée, illustrée par l'utilisation clinique de l'ivabradine, seule molécule sur le marché actif sur ce canal ionique 2 . De nombreux variants sont recensés dans les banques de données telles que ClinVar ou gnomAD, pour lesquels, aucune étude fonctionnelle ne permet de les classer sur le plan de la pathogénicité. Par ailleurs, il existe également un lien intéressant entre vieillissement et implication physiopathologique des canaux HCN, du fait de la modification de leur expression au cours de l'âge, prédisposant à un risque accru de fibrillation atriale 1 . A côté du rôle majeur des canaux HCN dans la régulation des PA cardiaques du fait de leur implication dans l'excitabilité de la membrane plasmique, des études récentes montrent une localisation subcellulaire non canonique des canaux HCN au niveau mitochondrial 3,4 . Ces données suggèrent la possibilité d'un couplage direct entre fonction des canaux HCN et fonctions mitochondriales, positionnant ces canaux comme « carrefour » entre activité électrique du tissu cardiaque et son métabolisme. Cette hypothèse de travail reste à démontrer. Dans ce contexte, ce projet de thèse ambitionne de mieux comprendre les relations entre des variants rares du gène HCN4 et des arythmies cardiaques, notamment au travers de l'exploration de leurs impacts sur les fonctions mitochondriales.
Ce projet de thèse combinera des approches multidisciplinaires incluant de la bio-informatique, d'étude de l'expression au niveau cellulaire et subcellulaire, d'imagerie haute résolution et des approches fonctionnelles (électrophysiologie, respiration mitochondriale...). Ce projet s'inscrit dans une démarche translationnelle, reliant recherche fondamentale et applications cliniques en adéquation avec les thématiques actuelles et futures de l'unité. Il permettra au doctorant d'acquérir des compétences dans un champ disciplinaire de la recherche en cardiologie et de technologie de pointe (électrophysiologie, imagerie haute résolution, protéomique...).

Références :

1. Rivolta I, Binda A, Masi A, DiFrancesco JC. Cardiac and neuronal HCN channelopathies. Pflugers Arch - Eur J Physiol 2020;472(7):931-951.
2. León-Aparicio D, Salvador C, Aparicio-Trejo OE, et al. Novel Potassium Channels in Kidney Mitochondria: The Hyperpolarization-Activated and Cyclic Nucleotide-Gated HCN Channels. IJMS 2019;20(20):4995. 3. Padilla-Flores T, López-González Z, Vaca L, et al. Funny channels in cardiac mitochondria modulate membrane potential and oxygen consumption. Biochemical and Biophysical Research Communications 2020;524(4):1030-1036. 4. Santoro B, Shah MM. Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Channels as Drug Targets for Neurological Disorders. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2020;60(1):109-131. 5- Houdayer C, Phillips AM, Chabbert M, et al. HCN2 Associated Neurodevelopmental Disorders: Data from Patients and Xenopus Cell Models. Annals of Neurology 2025;98(3):573-589. Pour la réalisation de ce projet, le laboratoire est équipé pour tout ce qui concerne la culture cellulaire, et les deux modèles cellulaires (HL-1 et hiPSC-CM) sont déjà établis au laboratoire. L'imagerie cellulaire (haute résolution) et la PCR digitale seront menées sur les plateformes de la SFR ICAT (SCIAM et PACEM). L'équipe Carme dispose d'un poste de patch-clamp pour les études électrophysiologiques (expertise du groupe du professeur Christian Legros) et l'équipe Mitolab maîtrise la technologie SeaHorse pour l'exploration des fonctions mitochondriales. Nous avons une collaboration bien établie avec l'institut du Thorax pour l'utilisation de l'automate de patch-clamp (Michel De Waard) et le système IonOptix (Dr Flavien Charpentier). Nous avons également une collaboration avec le Professeur Piotr Koprowski (Laboratory of Intracellular Ion Channels, Nencki Institute of Experimental Biology, Warsaw, Pologne) pour développer au laboratoire le patch-clamp sur mitoplast ou mitochondrie isolée. Par ailleurs, l'équipe CarMe interagit étroitement avec le service de cardiologie du CHU d'Angers, dont certains cliniciens émargent dans cette équipe (Pr. Fabrice Prunier...) pour la récolte de données cliniques des patients porteurs des variants rares du gène HCN4 (GeneMatcher). Concernant l'approche protéomique, une collaboration existe déjà avec la plateforme Ibiza ProtIco (Benjamin Barré associé à CarMe, François Guillonneau). Il a été prévu un co-encadrement avec le Dr Harmonie Perdreau-Dahl, actuellement post-doctorante dans l'unité MitoVasc jusqu'à fin juin 2026 et qui va ensuite rejoindre son ancien laboratoire en Norvège (Institute for Experimental Medical Research (IEMR), Oslo University Hospital and University of Oslo, Norway) pour une période d'environ une année. Le projet se fera avec sa collaboration, et nous prévoyons un séjour pour le/la doctorant·e dans ce laboratoire au cours du 2nd semestre de l'année universitaire 2026-27 (avec le dispositif MIR ou de soutien de l'EDBS pour la mobilité international). Lors de ce séjour, le/la doctorant·e se formera aux techniques relatives à l'étude et à la caractérisation des hiPSC-CM et à l'imagerie calcique par microscopie. Des demandes de financements sont en cours en réponse à des AAP (fondation avenir, FFC, fondations Maladies rares...). La dotation de l'Université sera également utilisée (4-5000 €/an). Une bourse de l'IUT sera demandée également pour environner des doctorants encadrés par les enseignants-chercheurs de l'IUT. Par ailleurs, ce projet s'inscrit dans une collaboration interéquipe au sein de l'unité MitoVasc qui soutient à hauteur de 5000 € les projets à l'interface des deux équipes. Chaque battement cardiaque résulte de la contraction synchrone de millions de cellules musculaires cardiaques, amorcée de manière remarquable par un seul potentiel d'action (PA). Ce processus repose sur la conversion intracellulaire efficace du signal électrique en force contractile mécanique, processus connu sous le nom de couplage excitation-contraction (ECC). Les PA cardiaques sont initiés dans le noeud sino-auriculaire (SAN), le principal pacemaker du coeur, par une séquence coordonnée de courants ioniques. Parmi les canaux ioniques et transporteurs responsables de la dépolarisation, les canaux activés par hyperpolarisation et modulés par les nucléotides cycliques ( HCN ) jouent un rôle majeur dans la régulation de l'automaticité cardiaque. Ils génèrent un courant dépolarisant lent If (« funny ») , responsable du déclenchement spontané des PA et qui présente un rôle déterminant dans la fréquence cardiaque intrinsèque. La famille HCN compte 4 isoformes (HCN1-4), HCN4 étant l'isoforme la plus abondante du SAN et HCN1/HCN2 étant principalement exprimés dans les myocytes atriaux et ventriculaires 1 . Chez l'animal, il a été montré que des altérations de l'expression des canaux HCN2 et HCN4 sont associées à une augmentation du risque de fibrillation atriale ou d'arythmies. Chez l'Homme, plusieurs variants du gène HCN4 ont été identifiés chez des patients présentant des arythmies cardiaques (syndrome de Brugada) et de dysfonction du noeud sinusal 1 . Ainsi, les canaux HCN sont associés à diverses pathologies cardiaques, et constituent une cible thérapeutique validée, illustrée par l'utilisation clinique de l'ivabradine, seule molécule sur le marché actif sur ce canal ionique 2 . De nombreux variants sont recensés dans les banques de données telles que ClinVar ou gnomAD, pour lesquels, aucune étude fonctionnelle ne permet de statuer sur leur pathogénicité. Par ailleurs, il existe également un lien intéressant entre vieillissement et implication physiopathologique des canaux HCN, du fait de variations de leur expression au cours de l'âge, prédisposant ainsi à un risque accru de fibrillation atriale.
A côté du rôle majeur des canaux HCN dans la régulation des PA cardiaques du fait de leur implication dans l'excitabilité de la membrane plasmique, des études récentes montrent une localisation subcellulaire non canonique des canaux HCN au niveau mitochondrial 3,4 . Ces données suggèrent l'existence d'un couplage fonctionnel entre les canaux HCN et la mitochondrie, positionnant ces canaux comme « carrefour » entre activité électrique du tissu cardiaque et son métabolisme. Cependant, cette hypothèse de travail reste à confirmer.

Ainsi, ce projet de thèse a pour but d'explorer le rôle des canaux HCN dans la physiopathologie cardiaque, en particulier en lien avec des variants rares du gène HCN4 et leurs conséquences fonctionnelles au niveau cellulaire et subcellulaire, notamment sur la fonction mitochondriale. L'objectif principal sera de mieux comprendre comment des altérations de ce canal peuvent perturber les fonctions cellulaires des cardiomyocytes par des approches pluridisciplinaires.

Le projet sera articulé en trois tâches interdépendantes :

Sélection de variants du gène HCN4 et analyses structurales (approches in silico ). Recherche de signaux d'adressages subcellulaire dans les séquences des canaux HCN. Une étude bioinformatique sera menée sur les séquences des canaux HCN1-4 sur des serveurs d'analyse des signaux d'adressage subcellulaire, en particulier vers les mitochondries (BUSCA et DeepLoc 2.0). Identification et sélection de variants rares du gène HCN4. Celle-ci sera effectuée sur le serveur gnomAD4, accompagnée d'une étude bibliographique, une sélection de variants du gènes HCN4 portés par des patients présentant des troubles du rythme cardiaque. Une recherche de patients sera également conduite via la plateforme GeneMatcher comme il a été réalisé dans une étude publiée récemment par l'équipe 5 . 1.3 Analyses de l'impact des variants sur la structure 3D du canal par modélisation (Modeller). Une modélisation des variants sélectionnés sera réalisée pour caractériser leur impact sur la stabilité, la flexibilité de la structure 3D d'HCN4. Caractérisation de l'expression des canaux HCN et de ses partenaires dans deux modèles de cellules cardiaques. Au laboratoire, deux lignées modèles sont utilisées en routine : une lignée de cardiomyocytes atriaux murin (HL-1) et de cardiomyocytes dérivés de cellules souches humaines (hiPSC-CMs). 2.1 Etude de l'expression des différents sous-types des canaux HCN dans différents compartiments cellulaires. L'expression des canaux HCN sera évalué au niveau transcriptionnel (PCR digitale) et protéique. Cette dernière reposera sur des techniques de fractionnement cellulaire (isolement des fractions mitochondriales et sarcolemmales) suivies de Western-blot. 2.2 Identification des partenaires des canaux HCN4 par protéomique. Pour atteindre cet objectif, nous utiliserons deux approches complémentaires : i) technologie du TurboID basée sur la biotinylation des protéines environnantes d'HCN4 et ii) immunoprécipitation couplée à la spectrométrie de masse. 2.3 Imagerie cellulaire. La localisation subcellulaire du canal HCN4 sauvage et des variants sélectionnés ci-dessus, microscopie confocale et par microscopie à super-résolution (STORM), afin d'identifier d'éventuelles redistributions intracellulaires, notamment au niveau mitochondrial (impact sur le réseau mitochondrial), et d'évaluer leur pertinence physiologique. Etudes fonctionnelles in vitro des variants du gène HCN4 3.1 Etudes électrophysiologiques par patch-clamp du canal HCN4 sauvage et des variants dont l'adressage à la membrane plasmique est préservé, afin de caractériser les impacts sur les propriétés biophysiques et la modulation par l'AMPc. En ce qui concerne les variants gain de fonction, leur sensibilité à l'ivabradine sera évaluée. 3.2 Analyse des paramètres mitochondriaux, tels que la respiration mitochondriale, les rapports glucose/lactate et ATP/ADP, le taux d'ADNmt... Ces mesures seront réalisées sur des lignées exprimant les variants gain de fonction et perte de fonction, ainsi qu'en présence d'inhibiteurs des canaux HCN, pour démontrer l'implication du rôle du canal HCN4 dans la régulation de la fonction mitochondriale. 3.3 Etude de l'impact des variants du gène HCN4 sur le couplage excitation-contraction. Pour cette sous-tâche, le dispositif IonOptix destiné à l'enregistrement simultané du Ca2+ et de la contractilité des hiPSC-CMs contrôle et édités sera utilisé.
L'ensemble de ces approches multidisciplinaires permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires reliant les canaux HCN4 aux dysfonctions cardiaques, voire mitochondriales, et ouvrira vers des perspectives thérapeutiques innovantes ciblant ces canaux. Ce projet s'inscrit dans une démarche translationnelle, reliant recherche fondamentale et applications cliniques en adéquation avec les thématiques actuelles et futures de l'unité . Il permettra au doctorant d'acquérir des compétences dans un champ disciplinaire de la recherche en cardiologie et de technologie de pointe (électrophysiologie, imagerie haute résolution, protéomique...).
Références :
1. Rivolta I, Binda A, Masi A, DiFrancesco JC. Cardiac and neuronal HCN channelopathies. Pflugers Arch - Eur J Physiol 2020;472(7):931-951.
2. León-Aparicio D, Salvador C, Aparicio-Trejo OE, et al. Novel Potassium Channels in Kidney Mitochondria: The Hyperpolarization-Activated and Cyclic Nucleotide-Gated HCN Channels. IJMS 2019;20(20):4995. 3. Padilla-Flores T, López-González Z, Vaca L, et al. Funny channels in cardiac mitochondria modulate membrane potential and oxygen consumption. Biochemical and Biophysical Research Communications 2020;524(4):1030-1036. 4. Santoro B, Shah MM. Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Channels as Drug Targets for Neurological Disorders. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2020;60(1):109-131. 5- Houdayer C, Phillips AM, Chabbert M, et al. HCN2 Associated Neurodevelopmental Disorders: Data from Patients and Xenopus Cell Models. Annals of Neurology 2025;98(3):573-589.